Wpływ światła na zegar biologiczny, noc i sen

Autor: Russell G. Foster, profesor neurobiologii cyklu dobowego i kierownik wydziału okulistyki na Uniwersytecie Oksfordzkim.

Wprowadzenie

Naszym życiem rządzi czas i używamy go, aby wiedzieć, co mamy robić. Ale cyfrowy budzik, który budzi nas rano, czy zegarek na rękę, który informuje nas, że spóźniliśmy się na kolację, to nienaturalne zegary. Nasz organizm reaguje na znacznie bardziej stary rytm, który prawdopodobnie zaczął tykać na początku ewolucji wszelkiego życia.

W naszych genach i prawie w całym życiu na Ziemi są wbudowane instrukcje zegara biologicznego, który wyznacza upływ około 24 godzin. Zegary biologiczne lub „zegary dobowe” (około jedna doba) pomagają określić czas naszego snu i czujności, nastrój, siłę fizyczną, ciśnienie krwi i itp. W normalnych warunkach żyjemy zgodnie z 24-godzinnym cyklem jasno/ciemno, a nasz zegar dobowy wykorzystuje ten sygnał do dostosowania czasu biologicznego do dnia i nocy.

Zegar służy wtedy do przewidywania różnych wymagań 24-godzinnego dnia i dostrajania fizjologii i zachowania z wyprzedzeniem do zmieniających się warunków. Spada temperatura ciała, ciśnienie krwi i sprawność poznawcza, a wzrasta zmęczenie w oczekiwaniu na nocny sen. Przed świtem metabolizm jest nastawiony na oczekiwanie na zwiększoną aktywność po przebudzeniu.

Niewielu z nas docenia ten wewnętrzny świat, skuszeni pozorną swobodą wyboru pory snu, pracy, jedzenia, picia, czy podróżowania, kiedy tylko chcemy. Ale ta wolność jest iluzją. W rzeczywistości nie możemy działać niezależnie od porządku biologicznego, jaki narzuca zegar dobowy. Nie możemy pracować z taką samą wydajnością przez całą dobę.

Życie wyewoluowało na planecie, która doświadcza głębokich zmian pod względem naświetlenia w ciągu 24 godzin, a nasz organizm przewiduje te zmiany i aby prawidłowo funkcjonować, musi być wystawiony na działanie naturalnego wzorca światła i ciemności. A mimo to odrywamy się od otoczenia, zamieniając noce w dni za pomocą światła elektrycznego i izolujemy się w budynkach, które chronią nas przed naturalnym światłem. W tym krótkim artykule poruszane są niektóre z ważnych konsekwencji naszego coraz większego oderwania od słońca.

Rytm domowy w naszym organizmie

U podstawy mózgu, w strukturze zwanej przednią częścią podwzgórza, znajduje się skupisko około 50 000 neuronów, tzw. jąder nadskrzyżowaniowych podwzgórza (SCN). Jeśli w wyniku udaru lub guza obszar ten ulegnie uszkodzeniu, rytm dobowy przestaje działać, a procesy fizjologiczne przebiegają losowo w ciągu dnia. Odkrycie, że pojedyncze neurony jądra nadskrzyżowaniowego, odizolowane od wszystkich innych komórek, wykazują rytmy aktywności elektrycznej zbliżone do 24-godzinnych, pokazało, że podstawowe mechanizmy, które generują ten wewnętrzny dzień, muszą być częścią subkomórkowego mechanizmu molekularnego. Do tej pory powiązano około 14–20 genów i ich produktów białkowych z generowaniem rytmów dobowych.

Sercem zegara molekularnego jest pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego, która składa się z następującej sekwencji zdarzeń: geny zegara są transkrybowane, a informacyjne RNA (mRNA) przemieszczają się do cytoplazmy komórki i zachodzi ich translacja na białka. Białka oddziałują na siebie nawzajem, tworząc kompleksy, a następnie przemieszczają się z cytoplazmy do jądra i hamują transkrypcję własnych genów. Kompleksy białek zegara hamującego ulegają następnie rozkładowi, a główne geny zegara są uwalniane, aby wytwarzać swoje mRNA, a tym samym świeże białko. Ta pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego generuje prawie 24‑godzinny rytm produkcji i rozkładu białek, który koduje biologiczny dzień.

Pierwotne założenie było takie, że neurony jąder nadskrzyżowaniowych wspólnie napędzają 24-godzinny rytm lub narzucają go na procesy fizjologiczne i zachowanie. Jednak odkrycie, że wyizolowane komórki z niemal każdego narządu ciała wytwarzają geny/białka zegarowe w rytmie dobowym, doprowadziło do poważnej zmiany w naszym rozumieniu. Teraz doceniamy, że jądra nadskrzyżowaniowe podwzgórza działają jako główny rozrusznik, koordynując aktywność wszystkich zegarów komórkowych w sposób, który przyrównano do dyrygenta orkiestry regulującego czas wielu różnorodnych elementów większej całości. Gdy SCN nie działa, poszczególne zegary komórkowe układów narządów rozchodzą się i skoordynowane rytmy dobowe załamują się — powstaje stan zwany wewnętrzną desynchronizacją. Wewnętrzna desynchronizacja jest głównym powodem, dla którego czujemy się tak okropnie po locie do innej strefy czasowej (jet lag). Różne układy narządów — mózg, wątroba, jelita, mięśnie itp. — pracują w nieco innym czasie. Dopiero po wyrównaniu czasu wewnętrznego możemy znów normalnie funkcjonować.

Ilustracja: Ulrika Nilsson Carlsson

Nasze zegary biologiczne są inne — geny i hormony?

„W kilku badaniach wykazano, że późniejsze godziny rozpoczęcia nauki w szkole poprawiają czujność i zdolności umysłowe uczniów podczas porannych lekcji. Jak na ironię, podczas gdy młodzi dorośli mają tendencję do poprawy swoich wyników w ciągu dnia, ich starsi nauczyciele wykazują spadek wyników w tym samym okresie!” Nasze zegary biologiczne nie są takie same.

Jeśli rano masz bystry umysł i wcześnie kładziesz się spać, jesteś „skowronkiem”, ale jeśli nienawidzisz poranków i późno chodzisz spać, jesteś „sową”.

Terminy te zostały użyte do opisania prawdziwego zjawiska preferencji dobowych — godzin, kiedy wolisz spać i kiedy wykonujesz najlepiej swoją pracę. Preferencje dobowe są częściowo określane przez nasze geny zegarowe. Ekscytujące badania przeprowadzone w ostatnich latach wykazały, że niewielkie zmiany w tych genach są powiązane z szybkimi zegarami (krótszymi niż 24 godziny) skowronków lub wolniejszymi (dłuższymi niż 24 godziny) zegarami sów. Ale to nie tylko nasze geny regulują nasze dobowe preferencje. Godziny snu znacznie zmieniają się wraz z wiekiem.

W okresie dojrzewania pory snu i pobudki przesuwają się do coraz późniejszych godzin. Ta tendencja do późniejszego wstawania utrzymuje się do około 19,5 roku u kobiet i 21 lat u mężczyzn, kiedy to następuje odwrócenie i przesunięcie w kierunku wcześniejszych godzin snu i czuwania. W wieku 55–60 lat wstajemy tak wcześnie, jak wtedy, gdy mieliśmy 10 lat.

Te i podobne wyniki pokazują, że młodzi dorośli naprawdę mają problem ze wstawaniem rano. U nastolatków pora snu jest opóźniona i osoby te mają duże niedobory snu, ponieważ kładą się późno, ale nadal muszą wstawać wcześnie rano, aby iść do szkoły. Te rzeczywiste efekty biologiczne zostały w dużej mierze zignorowane w kontekście struktury czasu narzuconej nastolatkom w szkole.

W kilku badaniach wykazano, że późniejsze godziny rozpoczęcia nauki w szkole poprawiają czujność i zdolności umysłowe uczniów podczas porannych lekcji. Jak na ironię, podczas gdy młodzi dorośli mają tendencję do poprawy swoich wyników w ciągu dnia, ich starsi nauczyciele wykazują spadek wyników w tym samym okresie! Mechanizmy tej zmiany preferencji dobowych nadal są słabo poznane, ale uważa się, że są one związane z wyraźnymi zmianami w naszych hormonach steroidowych (np. testosteron, estrogen, progesteron) i ich szybkim wzrostem w okresie dojrzewania, a następnie wolniejszym spadkiem.

Zegary świetlne i czujność

Oko nawiązuje połączenie ze światem zewnętrznym nie tylko, aby widzieć, ale także dla poczucia czasu i wielu procesów czasowych zachodzących w naszym ciele.

Zegar nie jest zegarem, jeśli nie można go ustawić na czas lokalny — a zegary molekularne w jądrach nadskrzyżowaniowych podwzgórza są zwykle regulowane (uruchamiane) przez codzienną ekspozycję na światło o świcie i zmierzchu, wykrywaną przez oczy. Gdy zegar nie jest wystawiony na stabilny cykl światła/ciemności, skutkuje to dryfowaniem lub „swobodnym” rytmem dobowym lub zakłóceniem cykli.

Oderwanie się doby słonecznej jest powszechne w społeczeństwach uprzemysłowionych. Poniżej omówiony zostanie szczególny przypadek pracowników pracujących w trybie zmianowym, jednak odizolowanie od silnych sygnałów świtu i zmierzchu występuje w wielu różnych przypadkach. Na przykład na oddziałach intensywnej opieki pediatrycznej i dorosłych często stosuje się słabe i stałe światło. W takim środowisku można by oczekiwać, że rytmy dobowe będą dryfować i ulegać desynchronizacji. Rezultatem, jak omówiono poniżej w podrozdziale „Zakłócenie zegara”, będzie osłabienie stanu zdrowia pacjenta. Światło nie tylko reguluje godziny rytmów dobowych, ale ma również bezpośredni wpływ na czujność i wydajność.

Badanie obrazowe mózgu po ekspozycji na światło wykazuje zwiększoną aktywność w wielu obszarach mózgu związanych z czujnością, funkcjami poznawczymi i pamięcią (wzgórze, hipokamp, pień mózgu) oraz nastrojem (ciało migdałowate). Ponadto wykazano, że zwiększone światło poprawia koncentrację, zdolność wykonywania zadań poznawczych i zmniejsza senność. W rezultacie nieodpowiednia ekspozycja na światło w budynku nie tylko zakłóci sen i rytm dobowy, ale także poziom czujności i wydajności.

Specjalne fotoreceptory w komórkach zwojowych nerwu wzrokowego synchronizują nasz zegar wewnętrzny z cyklami światła i ciemności w naszym otoczeniu, a tym samym z czasem lokalnym.

W ciągu ostatnich kilku lat nasze zrozumienie, jak światło reguluje rytm dobowy i czujność, znacznie się pogłębiło wraz z odkryciem całkowicie nowego systemu fotoreceptorów w oku. Ten nowy fotoreceptor nie znajduje się w części oka zawierającej pręciki (widzenie nocne) i czopki (widzenie dzienne), które są wykorzystywane do generowania obrazu świata, ale w komórkach zwojowych nerwu wzrokowego. Większość komórek zwojowych tworzy funkcjonalne połączenie między okiem a mózgiem, ale niewielka liczba wyspecjalizowanych komórek zwojowych (1–3%) jest bezpośrednio wrażliwa na światło i przenosi informacje do tych części mózgu, które biorą udział w regulacji rytmów dobowych, snu, czujności, pamięci i nastroju.

Te światłoczułe komórki zwojowe siatkówki (pRGC) zawierają światłoczuły pigment o nazwie Opn4, który jest najbardziej czuły w niebieskiej części widma (maksymalna czułość przy długości fali wynoszącej 480 nm) — bardzo podobnej do „błękitu” czystego nieba. Ten system wykrywania światła ewoluował, aby być anatomicznie i funkcjonalnie niezależnym od systemu wzrokowego i prawdopodobnie rozwinął się przed wzrokiem jako głównym sposobem wykrywania światła w celu wprowadzenia codziennych rytmów. Co godne uwagi, komórki pRGC mogą nadal wykrywać światło, aby przesunąć zegar dobowy lub wpłynąć na czujność, nawet u zwierząt lub ludzi, u których pręciki i czopki używane do widzenia są całkowicie zniszczone i którzy poza tym są całkowicie niewidomi. Rodzi to ważne skutki dla okulistów, którzy są w dużej mierze nieświadomi tego nowego układu fotoreceptorów i jego wpływu na fizjologię człowieka.

Biorąc pod uwagę wrażliwość pigmentu Opn4 na kolor, przewidywaliśmy, że niebieskie światło powinno być najskuteczniejszą długością fali (barwą) zmieniającą rytm dobowy i ostrzegającą systemy pobudzenia. We wszystkich dotychczas przeprowadzonych badaniach wykazano, że tak właśnie jest. Ekspozycja na niebieskie światło w nocy jest najskuteczniejsza w przesuwaniu czasu zegara dobowego, zmniejszaniu senności, poprawianiu czasu reakcji i aktywowaniu obszarów mózgu pośredniczących w czujności i śnie.

Oprócz spektrum, godziny, czas trwania, wzór i historia ekspozycji na światło wpływają na rytm dobowy i czujność. Szczególnie ważne są godziny ekspozycji na światło. Światło może przyspieszyć (wcześniejsze pójście spać) lub opóźnić (późniejsze pójście spać) system dobowy, w zależności od czasu ekspozycji. W warunkach ekspozycji na światło słoneczne światło o zmierzchu powoduje opóźnienie zegara, natomiast ekspozycja na światło o świcie przyspiesza zegar. Ten opóźniający i przyspieszający efekt światła utrzymuje związek jąder nadskrzyżowaniowych podwzgórza z dobą słoneczną.

Takie zróżnicowane efekty światła stają się niezwykle ważne, gdy próbujemy zrozumieć wpływ zmęczenia po zmianie strefy czasowej (jet lag), pracy w trybie zmianowym (patrz poniżej) lub projektu budowlanego na godziny snu/czuwania. Komórki pRGC nie są tak wrażliwe na światło jak pręciki i czopki, tak więc krótkie wystawienie na światło, które jest łatwo wykrywalne przez układ wzrokowy, nie jest przez nie rozpoznawane. Jednak przyciemnione światło może mieć wpływ, jeśli jest dostarczane przez długi czas. Tak więc stosunkowo słabe światło w pomieszczeniu, generowane przez lampki nocne i ekrany komputerowe (mniej niż 100 luksów), może mieć wymierny wpływ na zegar i układy pobudzenia przez kilka godzin i może zaostrzyć zaburzenia snu.

Łącznie te efekty światła — skład widma, czas ekspozycji i jasność — mają szerokie zastosowanie kliniczne i zawodowe nie tylko w leczeniu zaburzeń snu i zmęczenia, ale także w architekturze szpitali, szkół, biur, powierzchni handlowych i budynków mieszkalnych.

Zakłócenie zegara — praca w trybie zmianowym i społeczeństwa 24/7

Wprowadzenie elektryczności i sztucznego światła w XIX wieku oraz zmiana czasu pracy stopniowo odrywały nas od słonecznych 24‑godzinnych cykli światła i ciemności. Konsekwencją było zaburzenie rytmu dobowego i snu. Wiele napisano o skutkach tego zakłócenia i ogólnie rzecz biorąc, skutki są jasne (tabela 1). Zakłócenie snu i rytmu dobowego skutkuje deficytami wydajności, które obejmują zwiększoną liczbę błędów, słabą czujność i pamięć, skrócony czas reakcji psychicznych i fizycznych oraz zmniejszoną motywację.

Pozbawienie i zakłócenia snu są również związane z szeregiem nieprawidłowości metabolicznych, w tym z osią glukoza-insulina. Na przykład osoby z zaburzonym snem potrzebują więcej czasu na regulację poziomu glukozy we krwi, a stężenie insuliny może spaść do poziomu obserwowanego we wczesnych stadiach cukrzycy — nieprawidłowości, które można odwrócić przez normalny sen.

Takie wyniki sugerują, że długotrwałe zaburzenia snu i rytmu dobowego mogą przyczyniać się do chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca, otyłość i nadciśnienie. Ponadto otyłość jest silnie skorelowana z bezdechem sennym, a tym samym dodatkowymi zaburzeniami snu. W takich okolicznościach często może dojść do niebezpiecznego pozytywnego sprzężenia zwrotnego otyłości i zaburzeń snu. Utrata snu i zaburzenia rytmu dobowego są najbardziej widoczne u osób pracujących na nocnej zmianie. Ponad 20% populacji w wieku produkcyjnym pracuje przynajmniej przez pewien czas poza godzinami 07:00–19:00.

Długie fazy ewolucji człowieka miały miejsce w jasnym świetle słonecznym. Jednak to się zmieniło na początku ery przemysłowej i ma konsekwencje dla naszego zdrowia i psychiki, które dopiero dziś stopniowo stają się znane.

Josephine Arendt z University of Surrey mówi: „Z powodu szybko zmieniającej się i sprzecznej ekspozycji na światło i ciemność oraz aktywności i odpoczynku, pracownicy zmianowi mogą mieć objawy podobne do tych z jet lag. Chociaż podróżni zwykle dostosowują się do nowej strefy czasowej, pracownicy zmianowi zazwyczaj mają przesuniętą fazę w stosunku do lokalnych wskazówek dotyczących czasu”. Nawet po 20 latach pracy na nocną zmianę ludzie zwykle nie zmieniają rytmu dobowego w odpowiedzi na potrzebę pracy w nocy.

Pomimo wielkiej różnorodności i złożoności „systemów zmianowych”, żaden z nich nie był w stanie w pełni złagodzić dobowych problemów związanych z pracą zmianową. Metabolizm wraz z czujnością i wydajnością jest nadal wysoki w ciągu dnia, gdy pracownik nocnej zmiany próbuje zasnąć, a niski w nocy, gdy osoba próbuje pracować. Nieprawidłowa fizjologia oraz słaby sen pracowników na nocnej zmianie wiążą się ze zwiększoną śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych, ośmiokrotnie wyższą częstością występowania wrzodów trawiennych i wyższym ryzykiem zachorowania na niektóre formy raka. Inne problemy obejmują większe ryzyko wypadków, przewlekłe zmęczenie, nadmierną senność, trudności w zasypianiu oraz wyższe wskaźniki nadużywania substancji i depresji. Pracownicy na nocnej zmianie znacznie częściej postrzegają swoją pracę jako niezwykle stresującą.

Dlaczego więc pracownicy zmianowi nie przestawiają zegarków? Jeśli podróżujemy przez wiele stref czasowych, dochodzimy do siebie po podróży i przyzwyczajamy się do czasu lokalnego. Odpowiedź wydaje się być taka, że komórki pRGC, które przystosowują organizm do systemu dobowego, są dość niewrażliwe na światło. Zegar zawsze reaguje na jasne, naturalne światło słoneczne, a nie na słabe sztuczne światło powszechnie występujące w miejscu pracy. Nie jest to oczywiste, ale tuż po świcie naturalne światło jest około 50 razy jaśniejsze niż normalne oświetlenie biurowe (300–500 luksów), a w południe naturalne światło może być od 500 do 1000 razy jaśniejsze — nawet w Europie Północnej.

W ten sposób wystawienie na działanie silnego światła naturalnego w drodze do i z pracy, w połączeniu z niskim poziomem światła w miejscu pracy, sprawia, że osoba pracująca na nocną zmianę odczuwa czas lokalny. W ten sposób czas biologiczny i społeczny stale się rozbiegają u pracowników na nocnej zmianie. Jednak w przypadku braku naturalnego światła zegar w końcu zareaguje na sztuczne światło. Teoretycznie informacje te można wykorzystać do opracowania praktycznych sposobów przeciwdziałania problemom nocnej pracy.

Jednak większość osób pracujących na nocną zmianę woli nie przystosowywać się do odwróconego cyklu snu i czuwania, ponieważ lubią spędzać czas wolny od pracy z rodziną i przyjaciółmi, zachowując maksymalną czujność. Jedną z sugestii jest wybór osób do pracy zmianowej na podstawie ich preferencji dobowych – „sowy” mają naturalnie lepszą czujność w późniejszych godzinach i lepiej pracują na nocnej zmianie, natomiast „skowronki” zwykle lepiej przystosowują się do wczesno porannych zmian.

Ilustracja: Ulrika Nilsson Carlsson

Istnieje coraz więcej dowodów na złożoną i ważną interakcję między rytmem dobowym/zaburzeniami snu a układem odpornościowym. Pozbawione snu szczury szybko umierają na posocznicę, a u ludzi aktywność limfocytów NK może być obniżona nawet o 28% już po jednej nocy bez snu. Zakłócenie snu zmienia również wiele innych aspektów układu odpornościowego, w tym krążące kompleksy immunologiczne, wtórne odpowiedzi przeciwciał i wychwyt antygenów. Kortyzol tworzy ważny związek między układem odpornościowym, snem i stresem psychicznym. Zakłócenia snu i długotrwały stres psychiczny zwiększają stężenie kortyzolu we krwi. Jedna noc bez snu może podnieść stężenie kortyzolu o prawie 50% następnego wieczoru.

Wysoki poziom kortyzolu działa hamująco na układ odpornościowy, więc osoby przemęczone są bardziej narażone na zakażenia. W tym kontekście osoby pracujące na nocną zmianę są bardziej narażone na zachorowanie na niektóre rodzaje raka. Pojawiły się liczne spekulacje na temat przyczyny takiego stanu rzeczy. Ze względu na znaczny stres fizjologiczny i brak snu związane z pracą na nocną zmianę, upośledzenie odporności może tworzyć mechanistyczny związek ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka u osób pracujących na nocną zmianę.

Wnioski i perspektywy

Dyskusja w tym artykule dotyczyła zarówno biologii czasu wewnętrznego, jak i niektórych ogólnych problemów, jakie napotykamy, ignorując rolę snu i rytmu dobowego w naszym życiu. Teraz jest jasne, że kiepski sen, zmiany nastroju, obniżona wydajność poznawcza, zmniejszone umiejętności komunikacyjne i wyższe ryzyko chorób mogą wynikać z wymagań społeczeństwa działającego 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu. Jedną z konsekwencji tego upośledzenia funkcji mózgu jest zależność dużej części społeczeństwa od środków pobudzających stosowanych w ciągu dnia i środków uspokajających przyjmowanych w nocy w celu zastąpienia porządku normalnie narzucanego przez system dobowy.

Praca zmianowa jest być może najbardziej skrajnym przykładem, ale nie powinniśmy ignorować faktu, że wiele naszych dzieci w szkołach, pracownicy służby zdrowia w szpitalach oraz osoby pracujące w halach produkcyjnych i biurowcach są odizolowani od naturalnego światła. Zwiększy to nie tylko prawdopodobieństwo wystąpienia zaburzeń rytmu dobowego i snu, ale również znacząco wpłynie na ich funkcje poznawcze, nastrój i samopoczucie.

Jesteśmy gatunkiem, który ewoluował w warunkach jasnego oświetlenia — nawet w pochmurny dzień w Europie naturalne światło wynosi około 10 000 luksów, a w jasne, słoneczne dni może osiągać nawet 100 000 luksów. Mieszkamy jednak w domach i pracujemy w biurach, fabrykach, szkołach i szpitalach, które często są odizolowane od światła naturalnego i gdzie natężenie sztucznego światła często wynosi około 200 luksów i rzadko przekracza 400–500 luksów. Żyjemy w ciemnych jaskiniach. Nowoczesny projekt architektoniczny ma szansę, poprzez wpuszczenie światła do naszego życia, wyzwolić ludzkość z mroku i pozwolić naszym organizmom na wykorzystanie naturalnego cyklu światła i ciemności w celu optymalizacji naszego zegara biologicznego.

Dalsza lektura:

1. Foster, R.G. & Kreitzman, L. (2004) Rhythms of Life: The biological clocks that control the daily lives of every living thing. Profile Books, London.
2. Foster, R.G. & Wulff, K. (2005) The rhythm of rest and excess. Nat Rev Neurosci, 6, 407–414.
3. Foster, R.G. & Hankins, M.W. (2007) Circadian vision. Curr Biol, 17, R746–751.
4. Rajaratnam, S.M. & Arendt, J. (2001) Health in a 24-h society. Lancet, 358, 999–1005.
5. Zaidi, F.H., Hull, J.T., Peirson, S.N., Wulff, K., Aeschbach, D., Gooley, J.J., Brainard, G.C., Gregory-Evans, K., Rizzo III, J.F., Czeisler, C.A., Foster, R.G., Moseley, M.J. & Lockley, S.W. (2007) Short-wavelength light sensitivity of circadian, pupillary and visual awareness in humans lacking an outer retina. Curr Biol, 17, 2122–2128.